Napjainkban kiemelt jelentőségű problémának számít a perifériás artériás érbetegség hatékony kezelése, ezért világszerte folynak a kutatások olyan új, hatékony eljárások kifejlesztésére, amelyek képesek lehetnek megelőzni az iszkémiás végtag amputációját. Ezek között előkelő helyet foglalnak el a csontvelői eredetű őssejtek felhasználásán alapuló módszerek, melyeknek hatékonyságát a kezdeti klinikai vizsgálatok alátámasztják, mivel a vizsgálatokban igen bíztató eredményként, számos esetben korábban nem gyógyuló fekélyek jelentős mértékben javultak és szignifikánsan nőtt a dysbasiás távolság is. A jótékony hatások hátterében feltehetően az angiogenezis elősegítése áll. A legújabb, betegágy melletti módszerek segítségével a sejtek előkészítése már mindössze csak egy órát vesz igénybe, és ez tovább növelheti a terápia hatékonyságát, emellett a szélesebb körű elérhetőségét is lehetővé teheti. A jelenleg folyó nagy betegszámú, randomizált vizsgálatok, a későbbiekben az eljárás hatékonyságáról és biztonságosságáról további megerősítéssel szolgálhatnak és elvezethetnek a rutinszerű alkalmazás kidolgozásáig.

Érbetegségek: 2010/3. 33-38. oldal

KULCSSZAVAK

perifériás artériás érbetegség, csontvelői őssejt terápia, angiogenezis

Bevezetés

Az előrehaladott perifériás artériás érbetegség (PAD) kezelése komoly problémának számít világszerte, így hazánkban is. A háttérben álló ok leggyakrabban atherosclerosis, de thrombangiitis obliterans (Buerger-kór) is felelős lehet a kórkép kialakulásáért. A nagyobb perifériás artériák szűkülete az alsó végtagon kezdetben claudicato intermittensként jelentkezik, majd a folyamat krónikus végtagischaemiába (critical limb ischemia, CLI) progrediál, amelyet nyugalmi fájdalom és a lábszárakon jelentkező fertőzések, fekélyek és gangréna jellemeznek. Kezelésként elsősorban a revaszkularizációs eljárások jelenthetnek megoldást (sebészi vagy endovaszkuláris módszerek), azonban az esetek 30%-ában végül amputációra kerül sor. Magyarországon évente kb. 7500 végtagamputáció történik perifériás érbetegség miatt, Európa-szerte ez körülbelül évi 100.000 esetet jelent (1, 2). Az adatokból is kitűnik, hogy nagy szükség lenne olyan új terápiás eljárásokra, amelyekkel hatékonyabb kezelés válik megvalósíthatóvá. Az autológ csontvelői őssejtekkel végzett kezelések ígéretes új módszernek tűnnek a kezdeti kutatások alapján, amelyek rövid preklinikai fázis után hamar klinikai fázisba

1. ábra.
Csontvelői őssejtek (BMSC) differenciálódási útvonalai.

Őssejttípusok

A különböző őssejtterápiák kapcsán, kezdetben elsősorban az embrionális őssejtek (ESC) hatását vizsgálták. Ezek a sejtek három fő tulajdonsággal rendelkeznek: (1) differenciálatlan állapotúak, (2) képesek populációjukat mitotikus sejtosztódások által hosszú időn át fenntartani, a differenciálatlan állapot megváltozása nélkül (önreprodukció) és (3) bizonyos fiziológiai vagy kísérletes körülmények közt képesek specifikus funkciókat ellátó szerv- vagy szövetspecifikus sejtekké differenciálódni. Később azonban éppen a differenciálatlanságukból eredő esetleges tumorképző (pl. teratoma) hatásuk, illetve etikai aggályok vetették vissza a további vizsgálatokat. Ezután a multipotens felnőtt őssejtek (pl. autológ csontvelői eredetű őssejtek, aBMSC) kerültek előtérbe. A csontvelői őssejtek (BMSC) a legtöbbet kutatott és leginkább ismert őssejtcsoport, a klinikai kísérletek döntő többségében ezt a sejttípust alkalmazzák. A csontvelő a különböző progenitor sejtek komplex választékát tartalmazza, köztük hematopoetikus őssejteket, úgynevezett "side population" sejteket, mesenchymalis őssejteket és ezen belül multipotens felnőtt progenitor sejteket (1. ábra). A csontvelői őssejtek elkülönítése a többi csontvelői sejttől a c-kit marker kifejeződése alapján lehetséges, amely a sejtmigráció és proliferáció támogatásával hozható kapcsolatba (3). Egyébiránt a csontvelőben található hematopoetikus őssejtek (HSC) képesek bármely típusú vérsejt irányába differenciálódni, így kis mennyiség is elegendő belőlük a vérképző rendszer rekonstruálásához és ezt a tulajdonságot a klinikumban is felhasználják: 1968 óta végeznek csontvelő transzplantációt, amely az első klinikailag alkalmazott őssejt-kezelés. A HSC kinyerhető direkt módon a csontvelőből, illetve citokin (pl. granulocita kolónia-stimuláló faktor) kezelést követően nagyobb mennyiségben a perifériás vérből is.

I. táblázat.
Áttekintés a csontvelői őssejtes terápiák eredményeiről perifériás artériás érbetegségben.

Az őssejtterápia folyamata

A különböző kutatásokban az autológ csontvelői őssejtekkel végzett beavatkozások perifériás érbetegségben nagyrészt megegyező technikával folynak.
A beválasztás szempontjai: Olyan betegek vettek részt ezekben a kutatásokban, akik esetén konzervatív kezeléstől vagy sebészi revaszkularizációs eljárásoktól már nem várható javulás, illetve már korábban átestek ilyen kezeléseken. Az alanyok a fennálló PAD alapján Rutherford 4-6-os stádiumba, illetve Fontaine IIIb-IVa stádiumba tartoznak. A betegek kezelőorvosa bizonyos esetekben már amputációt javasolt. A betegek nem szenvedtek sem malignus tumoros betegségben, sem a csontvelőt érintő megbetegedésekben (1, 4).
A betegek vizsgálata a terápia megkezdése előtt: Az állapot felmérésére digitális szubtrakciós angiográfiát (DSA), a boka-kar index meghatározását (BKI), transzkután parciális oxigéntenzió-mérést (TcpO₂) és color Doppler-vizsgálatot végeztek. Bizonyos esetekben a dysbasiás távolság is meghatározásra került e betegekben.
Párhuzamos kezelések: Az antibiotikus terápiát, a trombózisprofilaxisra adott aspirint, illetve clopidrogelt, a béta-blokkolókkal, statinokkal vagy más szerekkel folytatott kezelést nem kellett felfüggeszteni (5). Ugyancsak változatlanul folyt a fekélyek lokális ellátása, beleértve a nekrotikus szövetek eltávolítását vagy a bőrtranszplantációt is (4).
A csontvelő kinyerése: az eddig elvégzett vizsgálatokban általában 100-800 ml csontvelőhöz jutottak lokál anesztéziában végzett cristabiopsziával (1, 2, 4).
A sejtek tisztítása, előkészítése: több eljárás is alkalmasnak bizonyult az őssejtszuszpenzió elkészítésére. A mágneses sejtszeparálás során CD34 markerre specifikus, mágneses részecskékkel jelölt antitesteket használnak fel. A szeparáló oszlopokon megtörténik a CD34+ frakció abszorpciója, majd ampullánként 1x10⁶ - 1,5x10⁷ sejtet használtak fel, 10 ml-es végtérfogatban, humánalbumin-glukóz-fiziológiás sóoldatban (1).
A terápiára felhasznált mononukleáris sejtek Ficoll_TM gradiens-centrifugálással vagy ennek különböző változataival is elkülöníthetőek (2, 6). Az izotóniás sóoldatban való mosási lépések után a sejtek Ringer-oldatban kerülnek felvételre 55-85 ml végtérfogatban (4).
Említésre méltó egy újszerű, "ágy melletti" előkészítést lehetővé tevő módszer (Harvest SmartPReP, Harvest Technologies, Plymouth, MA, USA). Ennek során ugyancsak gradiens centrifugálással választják el a csontvelői mononukleáris sejteket (4). Az eljárás több tekintetben is előnyösebb a korábbi elválasztási módszereknél. Az előzőekhez képest kisebb térfogatú aspirátum is elegendő, és így az általános anesztézia is elhagyhatóvá válik, helyette propofollal i.v. szedáció alkalmazható. A legfontosabb talán mégis az, hogy a sejtnyerés és a szuszpenzió elkészülése között korábban átlagosan 8-10 óra telt el, amelyet az új eljárás 1 órára rövidített (2). Ez a technika emellett egyszerűbb és olcsóbb a korábbiaknál, amely lehetővé teszi a terápia szélesebb körben való felhasználását (7).
Végül lehetőség van arra is, hogy több napon át tartó, költséges G-CSF injekció után, plazmaferézissel a perifériás vérből lehessen kinyerni a csontvelői eredetű mononukleáris sejteket. A módszer azonban nem jár terápiás előnnyel egyik fent említett eljárással szemben sem (2).
A sejtszuszpenzió bejuttatása: Két módszer szerepelt az eddigi kutatások során: az intramuszkuláris és az intraarteriális injekciós bejuttatási módok, illetve e kettő kombinációja.
Az intramuscularis (i.m.) injekciók a m. gastrocnemiusba kerülnek beadásra, szabályos elrendezésben, 20-60 injekció formájában (2. ábra) (1, 2). Más munkákban az injekciókat az elzáródott artéria mentén adták be, mert a kollaterálisképződés közvetlenül az elzáródott ér mellett a legnagyobb sűrűségű. Az injekciók száma ebben az esetben az elzáródott artéria nagyságától függött (8). Egyes esetekben közvetlenül a fekélyes felszín alá, illetve annak közvetlen környezetébe is bejuttatták a sejteket (4). Intraarteriális bejuttatás esetén a véráram szállítja el a sejteket az iszkémiás terület határáig (9, 10). Ezen a területen a sejtek túléléséhez szükséges tápanyagok, illetve oxigénmennyiség még rendelkezésre állnak.
Betegkövetés: Adott időközönként szükséges a terápia előtt elvégzett vizsgálatok megismétlése. A minimális betegkövetési időtartam 6 hónap volt (4).

2. ábra.
Az őssejtek intramuscularis (i.m.) alkalmazásának módja.

Eredmények

A terápia eredményességét a betegkövetés során időről időre elvégzett vizsgálatok és a beteg szubjektív értékelése alapján lehet megítélni. A megfigyelési szempontok általában a következők:

• boka-kar Doppler index mérése
• transzkután parciális oxigéntenzió mérése
• color Doppler vizsgálat
• dysbasiás távolság mérése
• a nyugalmi fájdalom szubjektív megítélése
• a fekélyek gyógyhajlama
• az amputáció szükségessége

Örömteli, hogy - mint ahogy az I. táblázatban is látható - őssejtterápiás klinikai vizsgálatok Magyarországon is folynak: Boda Zoltán debreceni munkacsoportja végzett kutatásokat csontvelői eredetű, CD34+ sejtpopuláció felhasználásával (1, 11). Igen bíztató, hogy egyes esetekben az őssejtterápia a korábban nem gyógyuló fekélyek begyógyulásához vezetett (3. ábra) (4).
Szót kell ejtenünk az eljárás biztonságosságáról is. Rövid- és hosszútávon is vizsgálták az esetleges mellékhatások, szövődmények megjelenését a kezelésen átesett betegekben. Több, hosszú betegkövetésű, nagy elemszámú tanulmány (4, 15), illetve kisebb elemszámú tanulmányok (1) is biztonságosnak minősítették az eljárást. A vizsgálati szempontok kiterjedtek lokális, illetve szisztémás hatásokra is.

3. ábra.
A BMSC terápia hatására az addig nem gyógyuló fekély teljesen begyógyult (A) 63 éves cukorbeteg férfi, Rutherford 5 stádium, 3 hónapos fekély, két sikertelen bypass műtét, TcpO₂: 5 Hgmm, BKI: 0,3. (B) 4 hónappal a terápia után később: TcpO₂: 37Hgmm, BKI: 0,63, Rutherford 3 stádium. (Amann és társai alapján (4)

Hatásmechanizmus

Az őssejtek az eddigi vizsgálatok alapján feltehetően fokozzák az angiogenezist az elzáródás környezetében. Két érformáló mechanizmus különíthető el, melyek közül mindkettő része lehet a hatásmechanizmusnak: A kapillárisbimbózás folyamata során a már korábban is meglévő kapillárishálózat fejlődése megy végbe. A hipoxia különféle növekedési faktorok, citokinek termelődését váltja ki, amelyek az endothelsejtek proliferációját és kapillárisok képződését indukálják. Ehhez a folyamathoz nincs szükség újonnan bevándorló sejtekre (16), ugyanakkor a képződött 10-20 µm átmérőjű kapillárisok nem alkalmasak arra, hogy megfelelő mértékben átvegyék egy nagyobb átmérőjű elzáródott ér szerepét. Egy kutatás során autológ csontvelői eredetű őssejtkezelésen átesett betegekből származó amputátumokat vizsgáltak. Ennek során új kapillárisok kialakulását tapasztalták a hypoxiás területeken, amelyek immunhisztokémiával vizsgálva endothelmarkerekre pozitívak voltak (CD31, CD34, vWF) (4. ábra) (17). Az nem teljesen egyértelmű, hogy a terápia során bejuttatott sejtek parakrin hatásokkal segítették-e elő az angiogenezist, vagy ezek a sejtek maguk is részeivé váltak-e az új kapillárisoknak. Ez a jelenség korábban nem volt megfigyelhető az amputátumokban (17).

4. ábra
Fokozott angiogenezis a BMSC-vel kezelt amputátumokban. (A) Hematoxilin-eozin festés; (B) anti-vWF festés.
Scale bars = 100µM. (Van Huyen es társai alapján (17)

Arteriogenesis során a meglévő kollaterális arteriolák átmérőjének megnövekedésérő van szó. Az eredeti arteriola átmérője akár 20-szorosára is megnövekedhet, és ezek az erek már képesek lehetnek kielégítő módon helyreállítani a vérkeringést az elzáródástól disztálisan (18). Valószínű, hogy ebben rejlik a magyarázat arra a klinikumból ismert tényre, hogy PAD során egyes betegekben nem fejlődnek ki iszkémiás tünetek. Ekkor a kollaterálishálózat megfelelő fejlettsége áll a háttérben (2). Az erek szűkülete vagy elzáródása nyomán létrejövő megnövekedett shear stress (nyírási feszültség) alapvető fontosságú az arteriogenezis beindulása szempontjából (19). A véráramlás ekkor a kollaterálisok felé terelődik át (20). Az endothelből ilyen esetben egyrészt olyan kemoattraktánsok szabadulnak fel, amelyek a vérben keringő, a monocita-makrofág fejlődési vonalhoz tartozó prekurzor sejtek kitapadását segítik elő a kollaterálisok belső falán, másrészt az ehhez szükséges adhéziós molekulák száma is megnő (21). A kitapadó prekurzorsejtek olyan mátrixproteázokat szecernálnak, amelyek segítségével lehetővé válik a kollaterális arteriolák növekedése. A fő artéria elzáródása után 4-6 héttel, ezen folyamatok képesek helyreállítani a vérkeringést a végtag disztális részein (22). A közelmúltban leírt keringő endothel progenitor sejtek (EPC) valószínűleg azonosak az előbbiekben említett sejtpopulációval (23). Az előbbiek alapján látható, hogy az angiogenezis középpontjában a csontvelői eredetű prekurzor sejtek állnak. Lényeges, hogy mindazok a tényezők, amelyek felelősek lehetnek az iszkémia kialakulásáért, szerepet játszhatnak az angiogenezis csökkent hatékonyságában, ezek közé tartozik a diabétesz, a dohányzás, a hiperlipidémia vagy az idős kor (24). A sejtterápiák során alkalmazott autológ, csontvelői eredetű őssejtek ezt a fiziológiás folyamatot képesek hatékonyabbá tenni (2).

A csontvelői őssejtes terápia jövője perifériás érbetegségben

Az autológ csontvelői őssejteket alkalmazó terápia az ismertetett eredmények alapján ígéretes új terápiás lehetőséget jelenthet a jövőben. A kezdeti eredmények megerősítésére számos nagy esetszámú klinikai vizsgálat indult el. Németrországban 4 helyszínen folyik a BONe Marow Outcome Trial in Critical Limb Ischemia (BONMOT-CLI) placebo-kontollált, kettős vak vizsgálat, mely 2010 nyarán zárul. Számos egyéb vizsgálat is folyik Hollandiában és az Egyesült Államokban (JUVENTAS, SCRIPT-CLI), melyek további megerősítéssel szolgálhatnak a későbbiekben az eljárás hatékonyságáról és biztonságosságáról. Az eredmények segítenek majd tisztázni olyan, jelenleg még megválaszolatlan kérdéseket is, mint azt, hogy melyik az optimális sejttípus, dózis és legmegfelelőbb bejutattási mód. Összefoglalva, a csontvelői eredetű őssejtek felhasználásán alapuló módszerek új, hatékony eljárásokat jelenthetnek, amelyek képesek lehetnek megelőzni az iszkémiás végtag amputációját.

Köszönetnyilvánítás

Jelen munka az OTKA 47095, 49488, 45933, 049621, ÖAD 66öu5, TÁMOP 4.2.2-08/1/KMR-2008-0004, Öveges és Bolyai ösztöndíjak támogatásával valósulhatott meg.

Irodalom

1. Boda, Z., et al., [Autologous bone marrow-derived stem cell therapy in patients with severe peripheral arterial disorder]. Orv Hetil, 2008. 149(12): p. 531-40.
   
   
2. Lawall, H., P. Bramlage, and B. Amann, Stem cell and progenitor cell therapy in peripheral artery disease. A critical appraisal. Thromb Haemost, 2010. 103(4): p. 696-709.
   
   
3. Orlic, D., et al., Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature, 2001. 410(6829): p. 701-5.
   
   
4. Amann, B., et al., Autologous bone marrow cell transplantation increases leg perfusion and reduces amputations in patients with advanced critical limb ischemia due to peripheral artery disease. Cell Transplant, 2009. 18(3): p. 371-80.
   
   
5. Conte, M.S., et al., Risk factors, medical therapies and perioperative events in limb salvage surgery: observations from the PREVENT III multicenter trial. J Vasc Surg, 2005. 42(3): p. 456-64; discussion 464-5.
   
   
6. Boyum, A., Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand J Immunol, 1976. Suppl 5: p. 9-15.
   
   
7. Prochazka, V., et al., Autologous bone marrow stem cell transplantation in patients with end-stage chronical critical limb ischemia and diabetic foot. Vnitr Lek, 2009. 55(3): p. 173-8.
   
   
8. Unthank, J.L., K.M. Sheridan, and M.C. Dalsing, Collateral growth in the peripheral circulation: a review. Vasc Endovascular Surg, 2004. 38(4): p. 291-313.
   
   
9. Bartsch, T., et al., Autologous mononuclear stem cell transplantation in patients with peripheral occlusive arterial disease. J Cardiovasc Nurs, 2006. 21(6): p. 430-2.
   
   
10. Yoshida, M., et al., Intra-arterial bone marrow cell transplantation induces angiogenesis in rat hindlimb ischemia. Eur Surg Res, 2003. 35(2): p. 86-91.
    
    
11. Boda, Z., Z. Vereb, and E. Rajnavolgyi, [Autologous bone marrow stem cell or peripheral blood endothelial progenitor cell therapy in patients with peripheral limb ischaemia]. Orv Hetil, 2006. 147(25): p. 1155-60.
    
    
12. Tateishi-Yuyama, E., et al., Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet, 2002. 360(9331): p. 427-35.
    
    
13. Gu, Y.Q., et al., Transplantation of autologous bone marrow mononuclear cells for patients with lower limb ischemia. Chin Med J (Engl), 2008. 121(11): p. 963-7.
    
    
14. De Vriese, A.S., et al., Autologous transplantation of bone marrow mononuclear cells for limb ischemia in a caucasian population with atherosclerosis obliterans. J Intern Med, 2008. 263(4): p. 395-403.
    
    
15. Matoba, S., et al., Long-term clinical outcome after intramuscular implantation of bone marrow mononuclear cells (Therapeutic Angiogenesis by Cell Transplantation [TACT] trial) in patients with chronic limb ischemia. Am Heart J, 2008. 156(5): p. 1010-8.
    
    
16. Hirota, K. and G.L. Semenza, Regulation of angiogenesis by hypoxia-inducible factor 1. Crit Rev Oncol Hematol, 2006. 59(1): p. 15-26.
    
    
17. Van Huyen, J.P., et al., Bone marrow-derived mononuclear cell therapy induces distal angiogenesis after local injection in critical leg ischemia. Mod Pathol, 2008. 21(7): p. 837-46.
    
    
18. Buschmann, I. and W. Schaper, The pathophysiology of the collateral circulation (arteriogenesis). J Pathol, 2000. 190(3): p. 338-42.
    
    
19. Schierling, W., et al., The role of angiogenic growth factors in arteriogenesis. J Vasc Res, 2009. 46(4): p. 365-74.
    
    
20. Pipp, F., et al., Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004. 24(9): p. 1664-8.
    
    
21. Chappell, D.C., et al., Oscillatory shear stress stimulates adhesion molecule expression in cultured human endothelium. Circ Res, 1998. 82(5): p. 532-9.
    
    
22. Kinnaird, T., et al., Bone marrow-derived cells for enhancing collateral development: mechanisms, animal data, and initial clinical experiences. Circ Res, 2004. 95(4): p. 354-63.
    
    
23. Rehman, J., et al., Peripheral blood "endothelial progenitor cells" are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors. Circulation, 2003. 107(8): p. 1164-9.
    
    
24. Vasa, M., et al., Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ Res, 2001. 89(1): p. E1-7.

Dr. Kiss Levente

Klinikai Kísérleti Kutató- és Humán Élettani Intézet,
Semmelweis Egyetem,
H-1094 Budapest, Tűzoltó utca 37-47.
Telefon: +36 20 384 5753, FAX: +36 1 334 3162,
E-mail: Ez az e-mail-cím a szpemrobotok elleni védelem alatt áll. Megtekintéséhez engedélyeznie kell a JavaScript használatát.

Érbetegségek: 2010/3. 33-38. oldal